操作步驟：
貼壁細(xì)胞
1、被檢細(xì)胞接種于無菌的 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為 1-2×10 4 。同時(shí)，接種正常無支原體感染的同種細(xì)胞，作為陰性對照。
2、5 天后，先吸去培養(yǎng)液，再加入 1ml 的固定液，靜置 20min，
3、吸去固定液，晾干。
4、于每孔中，加入 1ml 的 Hoechst33258 工作液（Hoechst 33258 工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞），37℃避光放置 15-20min 或室溫靜置 20～30min。
5、吸去 Hoechst 33258 工作液，加入 2ml 滅菌超純水洗滌三次，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封片液，并以蓋玻片覆蓋。
6、熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。

懸浮細(xì)胞：
1、收集需檢測的細(xì)胞，1500rpm，5min。
2、將收集的細(xì)胞涂片于載玻片上，再加 1ml 的固定液，靜置 20min。
3、吸去固定液，晾干。
4、于每孔中，加入 1ml 的 Hoechst33258 工作液（Hoechst 33258 工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞），37℃避光放置 15～20min 或室溫靜置 20～30min。
5、吸去 Hoechst 33258 工作液，用無菌水洗滌玻片 3 次，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封固液，并以蓋玻片覆蓋。
6、熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。
結(jié)果判斷（參考）：
陰性：僅見細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光。
陽性：除細(xì)胞外，細(xì)胞周圍可見大量的大小均一的熒光著色顆粒。
 
注意事項(xiàng)：
1．Hoechst 工作液對人體有害，請注意防護(hù)。
2．固定液有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行固定。
3．支原體檢測時(shí)，最好用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng) 2～3 代，這樣容易避免假陰性結(jié)果。
4．本試劑盒用于 6 孔板檢測時(shí)，可以進(jìn)行 50 次檢測反應(yīng)。
5． 檢測支原體污染， 可以使用支原體高效 Vero 細(xì)胞， 這樣可以提高檢測靈敏度， 即將被檢測樣品接種于 Vero細(xì)胞進(jìn)行檢測。

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