隨著病原微生物學(xué)、藥理學(xué)和腫瘤學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，科研部門和臨床醫(yī)院對抗腫瘤藥物、微生物病原體及活菌計(jì)數(shù)、細(xì)胞毒性的研究檢測工作日益增多，以往采用的檢測方法如同位素法、臺盼藍(lán)法以及 ELISA 法等，雖能測定出相應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但檢測過程中多因操作過程繁瑣、檢測周期長、需特定儀器設(shè)備、易污染環(huán)境等而不盡人意。長期以來，人們一直致力于探索新的更快速、更準(zhǔn)確的檢測方法來滿足科研部門和醫(yī)院測定工作的需要。MTT 比色法是20世紀(jì) 80 年代發(fā)展起來的一種檢測細(xì)胞數(shù)量和增殖狀況的方法，自Mosmann于1983年首創(chuàng) MTT 比色法用于檢測IL－2的生物學(xué)活性以來，MTT法憑借操作簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)而受到人們的普遍青睞，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。
 
1 MTT比色法的原理、方法及特點(diǎn)
1.1基本原理
MTT,即溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-dipenyl terazolium bromide〕,cas 298-93-1簡稱四唑鹽,又名噻唑藍(lán);MTT產(chǎn)品為淡黃色粉末,易被水溶解和透過細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)?？杀换罴?xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原,形成不溶于水的藍(lán)紫色Fortnazam結(jié)晶。該結(jié)晶可溶于酸性異丙醇、二甲亞砜、SDS等有機(jī)溶劑中,通過多孔掃描分光光度計(jì)依顏色深淺可測定出各吸光度值。由于結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)量及代謝活性成比例,因此吸光度(A)值的大小可反映細(xì)胞的數(shù)量及活性。
 
1.2基本操作過程
1.2.1制備靶細(xì)胞,將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中,根據(jù)靶細(xì)胞不同選擇每孔1口一1護(hù)個(gè)不同的細(xì)胞數(shù),預(yù)培養(yǎng)(或無)。
1.2.2加入待測的細(xì)胞因子或化學(xué)藥物等,同時(shí)設(shè)相應(yīng)的對照,置37℃5%CO2環(huán)境中培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間隨測定內(nèi)容及靶細(xì)胞不同而異。
1.2.3培養(yǎng)終止前4h加入5mg/ml的MTT溶液10～25μl/孔。
1.2.4終止培養(yǎng),將所形成的結(jié)晶物用有機(jī)溶劑完全溶解后,在分光光度計(jì)上測定其在波長490nm或570nm處的A值(不同溶劑使用測定波長不同)。用回歸法或概率法推算出活性因子的單位、藥物敏感性或效應(yīng)細(xì)胞殺傷率等。
1.3 MTT比色法的特點(diǎn)
1.3.1特異性強(qiáng)。因?yàn)殓晁崦摎涿钢淮嬖谟诨罴?xì)胞線粒體內(nèi),而不存在于上清液中,所以死細(xì)胞和紅細(xì)胞均不影響測定結(jié)果。
1.3.2靈敏度高。本法在檢測巨噬細(xì)胞毒活性閉、LAK細(xì)胞毒活性等時(shí)靈敏度均高于同位素法;在檢測抗癌藥物敏感性方面比臺盼藍(lán)法準(zhǔn)確、靈敏、特異。
1.3.3快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。培養(yǎng)和比色過程中不需洗滌細(xì)胞,省時(shí)并可避免細(xì)胞的丟失,而且比色測定可半自動化,受人的主觀因素影響較小,從而減少了樣品誤差,可同時(shí)對大樣本,多種因素進(jìn)行檢測。
1.3.4操作簡便、節(jié)省材料、不鑄特定儀器,無同位素污染,便于實(shí)驗(yàn)室開展應(yīng)用。
 
2 MTT比色法的應(yīng)用
2.1 植物抗細(xì)胞增殖物質(zhì)成分篩選研究中的應(yīng)用
2.1.1 中草藥提取物體外抗腫瘤活性
據(jù)《本草綱目》等記載，蛇六谷(魔芋)具有性寒、味平、化痰散積及行淤消腫之功，用于治療咳嗽、瘧疾、臃腫風(fēng)毒等 . 因有解毒抗癌之效而被現(xiàn)代用于治療各種惡性腫瘤 。采用 MTT 比色法觀察蛇六谷各提取物對人肝癌 HepG－2 細(xì)胞及大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞增殖抑制作用進(jìn)行藥物篩選，結(jié)果表明:蛇六谷醋酸已酯萃取物、石油醚萃取物對HepG－2細(xì)胞及C6細(xì)胞呈明顯的量效增殖抑制作用; 林董等也采用MTT比色法，對蕓香、低榆、甘草、柴胡、莪術(shù)、蜜蒙花、半邊蓮和旱芹等8種中草藥體外抗肺癌細(xì)胞SPC－A1的活性進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，濃度為1.5mg/mL的莪術(shù)乙醇浸提液(ESCC)和甘草乙醇浸提液(ESCG)對體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞SPC－A1呈較強(qiáng)的濃度依賴性抑制增殖作用。綜上實(shí)驗(yàn)都是通過MTT法來反應(yīng)細(xì)胞增殖狀態(tài)從而間接對中草藥體外抗腫瘤作用及機(jī)制的研究進(jìn)行了初步探討，為其臨床治療腫瘤提供了理論依據(jù)，且奠定了從天然中草藥中開發(fā)抗腫瘤新藥基礎(chǔ)，但其作用機(jī)制仍不太明確而有待進(jìn)一步研究 。
2.1.2 胡桃楸提取物抑制弓形蟲增殖
文秋嘉等收集感染弓形蟲小鼠腹水并稀釋至含蟲1×107個(gè)/mL，采用MTT比色法測定胡桃楸提取物(JMME)及其含藥血清對蟲體增殖情況的影響，同時(shí)設(shè)置乙酰螺旋霉素為對照組，結(jié)果顯示:胡桃楸提取物可明顯抑制弓形蟲增殖，且具有劑量依賴性，濃度大于30μg/mL 的抑蟲效果優(yōu)于乙酰螺旋霉素組(P＜0.05).弓形蟲可通過胎盤屏障垂直傳播至胎兒，孕婦感染可引起胎兒畸形( 無腦兒、脊柱裂)以及新生兒的先天性弓形蟲病(智力低下、癲癇、致盲及死亡)，嚴(yán)重影響優(yōu)生優(yōu)育 。研究表明: 胡桃楸提取物對弓形蟲具有明顯的增殖抑制和破壞作用，為研究體外抗弓形蟲藥物奠定了理論依據(jù) 。該實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用MTT比色法來觀察蟲體細(xì)胞在藥物作用下的增殖狀態(tài)，間接評價(jià)了藥物抗弓形蟲的作用效果，繼而避免了傳統(tǒng)弓形蟲計(jì)數(shù)采用的普通染色計(jì)數(shù)法所帶來的工作量大、誤差大的問題，適合抗蟲藥物的初步篩選。
2.1.3 烏骨藤對慢性髓性白血病細(xì)胞增殖抑制作用
烏骨藤始載于《滇南本草》，性味苦，微寒，具清熱解毒、消炎鎮(zhèn)痛與止咳平喘等功效，可治療肺炎、慢性支氣管炎、咳喘等疾病。現(xiàn)代藥理研究表明，烏骨藤含有多種甾體酯苷、生物堿、有機(jī)酸、多糖、樹脂及色素等多種化學(xué)成分，其獨(dú)特化學(xué)成分具有明顯的抗腫瘤活性。曾琛等通過 MTT比色法探討烏骨藤提取物是否對人慢性髓性白血病K562細(xì)胞存在抑制作用，結(jié)果表明：烏骨藤對 K562 增殖有明顯的抑制作用，同時(shí)亦可以明顯抑制人肺、胃、肝、大腸來源的癌細(xì)胞，且毒副作用輕微。但目前烏骨藤的抗腫瘤作用機(jī)制仍未完全闡明，其質(zhì)量控制指標(biāo)也有待商榷。
2.2 癌細(xì)胞電離輻射敏感性研究中的應(yīng)用
2.2.1 c－erbB－2－siRNA 對結(jié)腸癌細(xì)胞的放射增敏作用
趙東利等采用X射線單純放射和放射聯(lián)合應(yīng)用siRNA質(zhì)粒方法探討兩者對結(jié)腸癌細(xì)胞 HT－2放射增敏效果。通過MTT比色法測定不同劑量X射線在實(shí)驗(yàn)組(A組)與轉(zhuǎn)染試劑對照組(B組)、陰性質(zhì)粒對照組(C組)細(xì)胞吸光度(A值)，繼而計(jì)算比較各組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)( SF)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，A組在吸光度A值、SF實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均明顯低于B、C兩組;同時(shí)，從不同劑量X射線細(xì)胞周期分布數(shù)據(jù)表明，在相同SF下，A組所需X射線劑量最低。綜上說明，對結(jié)腸癌細(xì)胞HT－29進(jìn)行放射合并c－erbB－2－siRNA可起到放射增敏作用，能在較低劑量射線作用下降低細(xì)胞生存率。本實(shí)驗(yàn)通過凋亡調(diào)節(jié)改變腫瘤放射敏感性，對臨床在較小的毒副反應(yīng)下治療腫瘤提供一個(gè)新的思路。
2.2.2 肝癌細(xì)胞γH2AX表達(dá)與X射線劑量呈正相關(guān)
周萍等采用MTT比色法檢測不同劑量X射線照射肝癌細(xì)胞系HepG2后其吸光度A值及相應(yīng)死亡率，從而探討肝癌細(xì)胞γH2AX表達(dá)水平與電離輻射敏感性關(guān)系。數(shù)據(jù)顯示，1GyX射線照射時(shí)，HepG2死亡率為10.7%，以8GyX射線照射時(shí)，HepG2死亡率為47.4%。照射劑量在1～8Gy范圍內(nèi)增大，HepG2死亡率亦逐漸增高，HepG2死亡率與X射線劑量呈正相關(guān);同時(shí)，HepG2死亡率與表達(dá)γH2AX的細(xì)胞分?jǐn)?shù)高度相關(guān)r2=0.951，P＜0.05，HepG2灶點(diǎn)數(shù)與其死亡率高度相關(guān)，r2= 0.984，P＜0.05。綜上可知，X射線劑量與HepG2γH2AX表達(dá)呈正相關(guān)。
2.2.3 重離子誘導(dǎo)人舌鱗癌細(xì)胞凋亡
重離子因具有高傳能線密度，在腫瘤治療中比傳統(tǒng)的放射治療具有顯著優(yōu)勢. 有學(xué)者給予人舌鱗癌Tb細(xì)胞重離子束12C6+輻射，探討重離子對細(xì)胞凋亡及 Bax/Bcl－2蛋白表達(dá)影響，采用MTT比色法檢測細(xì)胞存活率。據(jù)MTT比色法繪制的劑量－效應(yīng)曲線顯示，Tb細(xì)胞經(jīng)12C6+輻射后，存活率顯著下降，呈劑量依賴性增殖抑制，其中12C6+輻射24h、48h后細(xì)胞存活率下降最為明顯。綜上說明，對Tb細(xì)胞給予24h以上的12C6+輻射，其DNA損傷程度高于自身基因修復(fù)能力，繼而凋亡相關(guān)基因被激活并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這意味著Tb細(xì)胞受重離子輻射后擺脫了對放射線抗拒期(G0/G1期)，而進(jìn)入對放射線敏感期(G2/M期)，這也是臨床分割放療和超分割放療的理論基礎(chǔ)之一，本實(shí)驗(yàn)為該理論提供了現(xiàn)實(shí)依據(jù)。
 
結(jié)束語
MTT法在很多領(lǐng)域都有應(yīng)用，在此就不一一敘述了，但是人們還是比較關(guān)心其在癌癥方面的應(yīng)用，希望通過它能夠找到治療癌癥的藥物，讓癌癥不再讓人覺得恐懼，讓我們?nèi)祟惖膲勖軌蚋L一點(diǎn)，能做更多的事。
 
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